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1、 流動(dòng)相

   手性分析很關(guān)鍵的一項(xiàng)是流動(dòng)相的選擇，手性分析一般都采用正相，使用zui多的流動(dòng)相是正己烷、正庚烷、乙醇和異丙醇這四種，其中起洗脫作用的流動(dòng)相是乙醇和異丙醇，正己烷和正庚烷用來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。正己烷和正庚烷對(duì)于樣品分離沒(méi)有什么太大的影響，不會(huì)改變選擇性和分離度，通常都可以混用，不過(guò)正庚烷比正己烷對(duì)人體的傷害要小很多，但價(jià)格是后者的一倍，所以歐美的很多大制藥公司多使用正庚烷，而國(guó)內(nèi)多使用正己烷。乙醇和異丙醇對(duì)樣品的分離起關(guān)鍵的作用，不同的醇有不同的選擇性，改變醇的種類可以改變選擇性，常用的醇類是乙醇和異丙醇，甲醇不能使用是因?yàn)樗驼和椤⒄椴换ト?，叔丁醇粘度太大，一般作為添加劑配合乙醇或者異丙醇少量使用，提供特殊的選擇性，通常能起到意想不到的效果。一般情況下分析手性樣品，很多人推薦異丙醇，因?yàn)橐掖細(xì)馕侗犬惐己靡稽c(diǎn)，且乙醇做流動(dòng)相壓力要低一些，實(shí)際上二者差別不是太大。

   流動(dòng)相里經(jīng)常需要添加酸或者是堿來(lái)調(diào)節(jié)峰形，常用的酸有、乙酸和甲基磺酸，堿一般是二乙胺和三乙胺，也有用乙醇胺和異丁胺的，流動(dòng)相里添加酸和堿的濃度一般要求控制在0.2%(體積比)以下，我們一般用0.1%，使用的原則一般是酸性樣品加酸，堿性樣品加堿，但實(shí)際上很多樣品是即含酸性基團(tuán)又含堿性基團(tuán)，這就要看哪個(gè)基團(tuán)作用強(qiáng)了，對(duì)于某些含氨基的兩性樣品，例如苯甘氨酸，甲基磺酸是一個(gè)非常好的選擇，磺酸基能夠抑制氨基的堿性，又能提供一個(gè)酸性的流動(dòng)相環(huán)境，使樣品既能得到很好的分離又能獲得對(duì)稱的峰形。

   一般做純度分析檢測(cè)雜質(zhì)含量時(shí)我們要求盡量的采用低波長(zhǎng)來(lái)讓盡可能多的雜質(zhì)有紫外吸收，而做手性分析時(shí)我們需要采用盡可能高的波長(zhǎng)來(lái)去除在低波長(zhǎng)下才有吸收的雜質(zhì)的干擾，一般原則還是盡量選擇樣品紫外吸收的地方來(lái)獲得較高的靈敏度，但流動(dòng)相里添加二乙胺會(huì)導(dǎo)致在低波長(zhǎng)下基線波動(dòng)變大，系統(tǒng)難以平衡，這種情況下一般要提高檢測(cè)波長(zhǎng)，實(shí)際操作過(guò)程中有些樣品在高波長(zhǎng)下吸收非常差，只能用低波長(zhǎng)檢測(cè)，這樣的樣品可以嘗試在樣品稀釋的時(shí)候加入過(guò)量的二乙胺(但不宜太多)，而流動(dòng)相用中性，從而獲得滿意的分析結(jié)果。有些樣品只添加堿或者酸效果不好，可以嘗試在樣品里同時(shí)添加酸或者堿，這種情況下通過(guò)酸堿同時(shí)加入，zui后獲得了非常漂亮的峰形和良好的分離度。實(shí)際操作中有些樣品堿性太強(qiáng)，進(jìn)樣以后根本不成峰，低波長(zhǎng)下細(xì)看似乎能感覺(jué)到基線一直在漂，開(kāi)始時(shí)懷疑樣品濃度不夠，加大樣品濃度以后仍看不到樣品峰，流動(dòng)相加入二乙胺或三乙胺以后再進(jìn)樣，得到比較漂亮的樣品峰。

  流動(dòng)相里添加酸或者堿以后，基本上不會(huì)提供額外的選擇性，但是卻能提高分離度，因?yàn)榉逍魏昧?，相同的保留時(shí)間兩個(gè)峰之間的分離度自然就好了。但是流動(dòng)相里添加酸或者堿以后，會(huì)在柱子上殘留，即使長(zhǎng)時(shí)間用中性流動(dòng)相沖洗也不會(huì)有什么效果，這一點(diǎn)在鍵合相手性柱上表現(xiàn)的尤為明顯。有時(shí)我們發(fā)現(xiàn)原來(lái)用中性流動(dòng)相分離很好的一個(gè)偏酸性的樣品，柱子用過(guò)堿性流動(dòng)相以后再用中性流動(dòng)相去做，發(fā)現(xiàn)樣品峰不能達(dá)到基線分離，拖尾嚴(yán)重，甚至不成峰，這時(shí)可以往流動(dòng)相里添加一滴酸，或者柱子用酸性流動(dòng)相沖洗一下再用中性的流動(dòng)相，一切又正常了，同理，用過(guò)酸性流動(dòng)相的柱子去做弱堿性的樣品會(huì)有一樣的問(wèn)題。殘留在柱子上的酸或堿是用堿或酸性的流動(dòng)相來(lái)清洗，有條件的話盡量固定一只柱子只用酸性流動(dòng)相或只用堿性流動(dòng)相。

2、 方法優(yōu)化

   做手性分析時(shí)一般選用兩只柱子：AD-H和IC，基本上這兩只柱子可以解決遇到的所有的手性化合物，AD-H是早期我們一直在使用的，后來(lái)的IC 可以使用更多的溶劑從而提供了更多的選擇性，但是習(xí)慣先用AD-H做手性分析方法開(kāi)發(fā)，手性分析基本上都用恒流來(lái)做，溶劑一般也都是提前混合好再放到儀器上用，主要是因?yàn)檎嗳軇┰趦x器上混合效果不好。

   如前邊所述，一般情況下拿到一個(gè)樣品，首先選擇的是用正己烷和乙醇做流動(dòng)相，根據(jù)化合物分子結(jié)構(gòu)式來(lái)判斷其極性的大小，進(jìn)而來(lái)選擇流動(dòng)相的比例，極性大的選擇使用的乙醇比例大一點(diǎn)，極性小的選擇使用的乙醇比例小一點(diǎn)，乙醇比例一般是從大到小，根據(jù)分離情況以5%或10%的比例遞減，一般要求*針至少能把樣品在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)從柱子上洗脫下來(lái)，然后再去做調(diào)整，如果開(kāi)始的時(shí)候醇的比例選的過(guò)小，樣品可能在柱子上一兩個(gè)小時(shí)都洗不下來(lái)。消旋體出峰以后如果是一個(gè)峰，可以將峰放大，觀察有沒(méi)有分叉的跡象，有的話，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)慕档痛碱惖谋壤齺?lái)進(jìn)一步提高分離度，如果分得太開(kāi)，可以適當(dāng)?shù)奶岣叽碱惖谋壤齺?lái)縮短分析時(shí)間，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的調(diào)整，使分析時(shí)間和分離度都能滿足手性分析的要求。如果樣品在使用一種醇類時(shí)沒(méi)有選擇性，即無(wú)論怎樣減小醇的比例樣品都沒(méi)有分離的跡象，可以換一種醇來(lái)試，通常乙醇和異丙醇會(huì)有不同的選擇性，很多樣品乙醇分不開(kāi)，異丙醇能分離的很好。異丙醇也不行的時(shí)候可以嘗試在乙醇或者異丙醇里加入合適濃度的叔丁醇或者是甲醇，對(duì)于IC色譜柱可以嘗試其它如二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯等其它溶劑，每一種溶劑都能為手性分析提供*的選擇性，一般除了乙醇、異丙醇之外我使用zui多的還是叔丁醇，其次是甲醇，叔丁醇可以單獨(dú)和正己烷做流動(dòng)相，甲醇必須結(jié)合乙醇或異丙醇混合使用。需要著重強(qiáng)調(diào)的是，更換醇的種類，有可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體出峰順序的改變，使用乙醇的流動(dòng)相，如果R構(gòu)型先出峰，更換為異丙醇以后，有可能(不是一定)R構(gòu)型會(huì)后出峰，S構(gòu)型跑到前邊去了。

   雖然提高柱溫能夠使峰形變窄變細(xì)，但是會(huì)降低分離度，而且大賽璐的手性柱溫度上限就是40度(這一點(diǎn)在超臨界流體色譜應(yīng)用上受限尤為明顯)，所以優(yōu)化分析方法時(shí)很少有人在柱溫上下功夫。另外手性柱分析樣品的保留時(shí)間受室溫變化的影響特別大，通常大家都習(xí)慣用消旋體圖譜計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體相對(duì)保留時(shí)間的方法根據(jù)主峰的保留時(shí)間來(lái)計(jì)算異構(gòu)體的出峰位置。